在细胞冻存过程中，冻融损伤是常见的现象，其主要表现为细胞存活率降低、功能失常以及形态改变。冻融损伤主要来源于冰晶形成、渗透压变化以及细胞内外的化学变化等因素。细胞在低温环境下冻结时，水分会结冰，导致细胞内外水分分布发生剧烈变化，这些变化往往会对细胞造成致命性损害。为了降低冻融损伤，科学家们提出了多种方法，如使用冷冻保护剂、优化冷冻速度、控制冷冻和解冻过程的温度梯度等。以下将详细探讨冻融损伤的具体原因及相关的解决措施。
冻融损伤的主要原因
1. 冰晶形成与细胞膜破裂
细胞冻存的一个关键问题是水分的结冰。在低温环境下，细胞内部的水分会冻结成冰晶。冰晶的形成会使水分在细胞内外发生移动，并可能导致细胞膜破裂。据研究表明，当温度降至-4℃至-10℃时，细胞内的水分开始结冰，而在-40℃以下，细胞外的水分会结冰。形成的冰晶会撕裂细胞膜，导致细胞死亡。在细胞冻结过程中，如果冰晶形成过大，细胞内的结构也会受到破坏，造成不可逆损伤。
2. 细胞内渗透压变化
当水在冷冻过程中冻结，细胞内的溶质(如盐、糖等)浓度会急剧增加，这会导致细胞内外的渗透压不平衡。渗透压的变化可能会导致细胞失水或吸水，进而引发细胞膨胀或收缩，增加细胞膜和细胞结构的压力。细胞在这些极端环境下可能会失去正常功能，导致死亡。
3. 冷冻保护剂的使用不当
冷冻保护剂(Cryoprotectant, CPA)是用于减轻冻融过程中损伤的重要化学物质。常见的冷冻保护剂如甘油、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)等，可以帮助细胞保持水分、减少冰晶形成。然而，过量使用冷冻保护剂或使用不适当的冷冻保护剂可能会导致细胞的毒性损伤。过高浓度的冷冻保护剂会增加细胞的渗透压力，并可能损害细胞膜结构。
4. 冷冻速度与解冻速度
冷冻和解冻的速度直接影响细胞冻融损伤的程度。过快的冷冻和解冻速度会使水分过快地结冰或过快地融化，造成细胞内外压力剧烈变化。研究表明，在冷冻过程中，慢速冷却(每分钟1°颁至5°颁)通常有助于减少冰晶的形成，而过快的冷却速度可能导致大冰晶的生成，进而增加细胞损伤的风险。在解冻过程中，快速解冻可避免冰晶在细胞内部重新结晶，减少损伤。
解决方法
1. 合理选择冷冻保护剂及其浓度
冷冻保护剂的选择和使用至关重要。在不同的细胞类型中，合适的冷冻保护剂及其浓度也有所不同。甘油通常用于哺乳动物细胞的冻存，而顿惭厂翱则是广泛应用于各种细胞冻存的标准保护剂。一般情况下，冷冻保护剂的浓度应控制在10%至15%之间。在实际操作中，为了减少冷冻保护剂的毒性，采用逐步加入冷冻保护剂的方式比直接加入更为温和。例如，先将细胞悬浮在冷冻保护剂中，逐渐增加浓度，这有助于细胞适应渗透压变化，减少冻融过程中的损伤。
2. 优化冷冻和解冻速度
冷冻和解冻的速度应根据具体细胞类型进行调节。一般而言，慢速冷冻能够减少冰晶的形成，并降低对细胞膜的损伤。常见的冷冻程序是将细胞缓慢冷却至-80℃，然后再转入液氮罐中。解冻时应迅速加热，通常使用37℃水浴进行快速解冻。解冻过程应避免长时间的温度波动，防止冰晶的二次形成。
3. 冷冻过程中的温度控制
温度的控制对于降低冻融损伤至关重要。细胞冻结时的温度应该逐步降低，避免急剧变化。冷冻速率在-1°颁至-5°颁/分钟之间较为理想。在液氮中储存的细胞可以在很低的温度下保持稳定，而在解冻时，应该尽量避免在室温下进行过长时间的暴露。细胞解冻的过程要迅速且平稳，以减少由于温差引起的损伤。
4. 细胞冻存后的存储条件
细胞冻存后的储存条件也会影响细胞的存活率。液氮罐是常用的细胞冻存储存设备，储存时应确保液氮罐内液氮的充足以及温度的稳定。细胞的冻存时间不宜过长，长期储存会增加冻融过程中细胞损伤的风险。一般而言，细胞的冻存时间可以控制在2至3年之内，但细胞类型不同，其最佳冻存期限也有所不同。
5. 多次冻融与冻存损伤
在细胞冻存和解冻过程中，反复冻融会显着增加冻融损伤的风险。实验中应尽量避免多次冻融，因每次冻融都可能对细胞造成额外的物理和生化损伤。若需要多次使用冻存的细胞，建议在每次解冻后分装并避免再次冻融。
在细胞冻存的实际操作中，以上各种方法和措施的结合可以有效减轻冻融损伤。通过优化冷冻方案、选择合适的冷冻保护剂并合理控制温度变化，能够显着提高细胞冻存的存活率和功能保留。在未来的研究中，对不同细胞类型的冻存过程进行更深入的探索，将有助于进一步提高冻存技术的精度和细胞保存的效果。
